Главная --> Справочник терминов


Конфигурации гликозидной Мы еще ничего не сказали о способах определения конфигурации гликозидных связей моносахаридных остатков

Выяснение конфигурации гликозидных связей — это по существу задача мономерного анализа, так как относится не к характеристике структуры цепей, а к детализации структуры отдельных звеньев. Тем не менее известными сейчас методами мономерного анализа эта задача не решается. Дело в том, что все эти методы по своей сути деструктивны и обязательно включают расщепление гликозидных связей. А при всех известных способах расщепления гликозидных связей, применяемых в мономерном (анализе полисахаридов (кроме ферментативного гидроли-8а, см. ниже), информация о конфигурации этой связи Меряется.

Мы уже упоминали, что гликозидный центр вносит наибольший вклад в величину удельного вращения углеводов. Поэтому из величины удельного вращения полисахарида можно сделать некоторые заключения о конфигурации гликозидных связей входящих в него моносахаридных остатков. Однако, поскольку удельное вращение — величина аддитивная *, такие заключения 'неизбежно носят усредненный характер, тГ'е. ничего'не говорят о том, какие именно остатки имеют а- или ^-конфигурацию. Лишь в простых и крайних случаях оптическая активность полисахарида позволяет сделать более определенные выводы. Действительно, по величине удельного вращения можно достаточно уверенно сделать заключение о преобладании гликозидных связей с такой-то конфигурацией в полисахаридах, построенных из однотипных моносахаридных остатков с одной конфигурацией гликозидных связей.

Совсем по-другому выглядит задача определения конфигурации гликозидных связей в олигосахаридах, особенно в низших олигосахаридах, получаемых при тех или иных способах фрагментации полисахаридных цепей. Дело в том, что при малом количестве гликозидных связей (в дисахаридах, например, такая связь только одна) удельное вращение уже позволяет с гораздо большей определенностью судить о конфигурации этих связей. Кроме того, в ди-, три-, а при удаче и в тетрасахаридах

По-видимому, универсальный (гипотетический) метод определения конфигурации гликозидных связей в полисахаридах можно представить себе следующим образом. Это должен быть такой метод расщепления гликозидных связей, который приводил бы количественно к производным моносахаридов подобно кислотному гидролизу. Но с той, однако, разницей, что структура этих производных должна зависеть от конфигурации расщепляемой глико-зидной связи исходного остатка. Тогда мы имели бы метод мономерного анализа, который одновременно давал бы информацию и о природе каждого мономерного звена, и о конфигурации его гликозидной связи. К сожалению, ничем похожим на такое идеальное решение углеводная химия пока не располагает (хотя препятствий принципиального характера к разработке подобного метода не видно). Наилучшее доступное сейчас приближение к идеалу — это окисление ацетатов полисахаридов хромовым ангидридом в уксусной кислоте. Суть этого метода состоит в следующем.

Описанный метод установления конфигурации гликозидных связей достаточно эффективен и широко применяется сейчас в структурных исследованиях за неимением лучшего. В нем, однако, заложено принципиальное несо-

Экзофермент, катализирующий гидролиз p-D-глюканов с 1-^3-связями, в частности ламинарина, до глюкозы (избегая строгой номенклатуры, назовем его ламинара-зой), высоко специфичен к типу гликозидных связей, т. е. расщепляет только связи 1—>-3. Поэтому, если изучаемый полисахарид под действием ламинаразы претерпевает полный гидролиз, можно уверенно утверждать, что он имеет регулярную структуру и построен только из (3-D-глюкопиранозных звеньев, соединенных 1->3-связями. Иными словами, исследование полисахарида при помощи ферментативного гидролиза дает сразу сведения и о мопо-мерном составе, включая конфигурацию и положение межмономерных связей, и о ближнем порядке звеньев, и о дальнем порядке остатков в цепях. На первый взгляд может показаться, что применительно к регулярному неразветвленному полисахариду ферментативный гидролиз дает информацию такого же характера, что и обычный мономерный анализ при помощи метилирования (если отвлечься от конфигурации гликозидных связей). Мы сейчас увидим, однако, что это не соответствует действительности. Допустим, мы изучаем глюкан со степенью полимеризации (числом моносахаридных остатков в цепи) 100. В результате его анализа методом метилирования в нем были обнаружены только 1->3-связи и не обнаружено других. Однако «не обнаружено» — понятие довольно неопределенное. Его истинный смысл можно оценить, только зная чувствительность примененных аналитических методов. В нашем случае это чувствительность обнаружения минорных компонентов в смеси производных метили-

чении клетки печени не только выдадут нужную организму глюкозу, но и быстро разрушат сами себя. Однако и замок должен точно соответствовать ключу. Иными словами (и тут мы вплотную подходим к вопросу о специфичности полисахаридных структур), вариации структуры гликогена допустимы лишь в таких пределах, в которых он сохраняет способность быть хорошим субстратом для расщепляющих его ферментов печени. А это, как мы видели, очень узкие пределы, не допускающие, например, ни наличия в молекуле фуранозных звеньев, ни изменения конфигурации гликозидных связей, ни наличия меж-мономерных связей, отличных от 1—>4 и 1—>6, ни замены части остатков глюкозы на остатки других моносахаридов и т. д. На любой из таких аномалий, даже если их содержание в молекуле незначительно, ферментативное расщепление гликогена приостановится, и вся остальная, и весьма значительная, часть полисахаридной молекулы не сможет быть вовлечена в обмен *.

Метод, позволяющий получить информацию о конфигурации гликозидных связей в полисахаридах при условии, что известен их моносахаридный состав и положения моиосахаридных звеньев, создан на основе спектроскопии ЯМР. Гидроксигруппы углеводных остатков превращают (преимущественно) в 0-метильные или О-триметилсилильные для исключения из спектров сигналов гидр-оксигрупп. Сигналы протонов при аномериых атомах углерода находятся в более низком поле, чем сигналы остальных протонов, причем химические сдвиги сигналов экваториальных протонов выше, чем для аксиальных. Полный структурный анализ полисахаридов осуществлен на основании данных спектров ЯМР 'Н метилированных моносахаридов и спектров ЯМР 'Н простых полисахаридов, таких как гликогены [56]. Методы спектроскопии ЯМР 13С, 19F и 31Р также могут быть использованы при определении места присоединения одного моносахарида к другому, причем в двух последних методах используются такие производные полисахаридов, как [19F] -трифторацетаты.

В ЯМР-спектре пики аномерных протонов, занимающих аксиальное и экваториальное положение, различаются весьма резко (подробнее см. гл. 2). Сднако эти методы неудобны для определения конфигурации гликозидсв со сложными агликонами, так как в этих случаях весьма затрудняется интерпретация спектров. Обычно ИК- и ЯМР-спектроскопия применяются для установления конфигурации гликозидных связей только в более простых гликозидах.

Весьма ценный метод определения конфигурации гликозидных связей заключается в исследовании отношения гликозидов к гликозидазам — ферментам, расщепляющим гликозидные связи (см. гл. 13). Поскольку действие всех известных гликозидаз стереоспецифично, способность определенного фермента катализировать гидролиз исследуемого гликозида позволяет установить конфигурацию гликозидной связи последнего. Так, например, способность р-глюкозидазы вызывать гидролиз арбутина — p-D-глюкопиранозида гидрохинона — доказывает р-конфигурацию гликозидной связи в этом соединении S6. Однако гликозидазы специфичны не только к конфигурации гликозидной связи, но и к стереохимии глико-зильного остатка, и, кроме того, чувствительны к природе агликона. Поэтому неспособность данного соединения к гидролизу под влиянием того или иного фермента не может служить окончательным доказательством конфигурации его гликозидной связи. С другой стороны, при работе с гликозидазами необходимо постоянно считаться с возможным присутствием примесей других ферментов (например, примесь (3-глюкоз ид азы в а-глюкозидазе), способных исказить результаты гидролиза (см. также стр. 449).

Простой и изящный метод определения размера кольца гликози-дов и конфигурации гликозидной связи, который разработали Джексон и Хадсон (1936), состоит в окислении углеводов и их производных йодной кислотой в водном растворе. Пиранозид I потребляет два моля подпой кислоты, а фуранозид III—один моль, причем оба вещества дают с высоким выходом одинаковый диальдегид II. При окислении соединения I удаляются три центра асимметрии, а атом Сз отщепляется в виде муравьиной кислоты; при окислении соединения III исчезают два центра асимметрии:

fl F Скорости гидролиза гликозидных связей варьируют' достаточно широко в зависимости от природы гликозид-ного остатка, конфигурации гликозидной связи и особенно сильно — от размера цикла. Для пиранозных звеньев обычных альдоз примерные условия полного гидролиза: 1 н. минеральная кислота, 100° С, несколько часов. Для фуранозных звеньев: 0,01 н. минеральная кислота, 100° С, 1—2 часа.

В самом деле, гидролиз осуществляют в сильнокислых средах. Поэтому образовавшиеся моносахариды мгновенно (или во всяком случае неизмеримо быстрее, чем идет гидролиз) достигают мутаротационного равновесия. Таким образом, каков бы ни был размер цикла моносахаридного остатка в полисахаридной цепи и какова бы ни была конфигурация его гликозидной связи, образующийся моносахарид будет получен в одной и той же форме — равновесной смеси, состав которой определяется только условиями среды, а отнюдь не структурой соответствующего звена в полисахаридной цепи. Иными словами, вся информация о размере цикла и о конфигурации гликозидной связи будет необратимо потеряна в результате гидролиза.

* Заметим, что такой опосредованный вывод о последовательности не позволяет судить о конфигурации^гликозидной связи остатка 3,6-ангидро-Ь-галактопиранозы (вт отличие от остатка p-D-галактопиранозы, конфигурация которого непосредственно следует из структуры агаробиозы).

Главная особенность ферментов как инструментов структурного анализа полисахаридов — высокая, в некоторых случаях абсолютная, специфичность их действия. Ферменты, расщепляющие полисахариды (полисахарида-зы), как правило, абсолютно специфичны к конфигурации гликозидной связи (например, фермент, настроенный на гидролиз а-гликозидной связи, совершенно не действует на (3-гликозидные связи), абсолютно специфичны к размеру цикла моносахаридного остатка и высоко специфичных к структуре и конфигурации самого моносахаридного звена. Кроме того, и это особенно важно для установления строения полисахаридов, полисахаридазы обычно высоко избирательны к типу связей и к структуре остатков в ближайшем окружении к расщепляемой гликозидной связи. Поэтому уже сам факт расщепления определенной связи данным ферментом нередко дает много сведений о ближнем порядке остатков в этом участке цепи (пример такой избирательности лизоцима мы уже рассматривали в другом аспекте).

Для установления типа гликозидной связи (а- или 0-) применяют методы ферментативного гидролиза различными гидролизующими ферментами (гидролазами), мягкий кислотный гидролиз и др. ИК-спектроскопию используют для установления конфигурации гликозидной связи, наличия в макромолекуле полисахарида тех или иных функциональных групп, а также для изучения водородных связей. В последние годы для изучения химического строения полисахаридов все большее значение приобретает метод 13С-ЯМР-спектроскопии.

Следует подчеркнуть, что при гидролизе целлюлозы и крахмала, независимо от конфигурации гликозидной связи, после полного гидролиза, как и при мутаротации, получается одна и та же равновесная смесь тауто-мерных форм D-глюкозы, главным образом p-D-глюкопиранозы, a-D-глюкопиранозы и небольшого количества открытой альдегидной формы (схема 11.5); фуранозными формами можно пренебречь. То же самое относится и к другим моносахаридам. Поэтому в схемах гидролиза принято использовать условное обозначение для смеси аномерных концевых редуцирующих звеньев. Превращение р-аномера в a-аномер и обратно происходит только через открытую форму.

Для определения конфигурации гликозидной связи между остатками моносахаридов использовали в основном ферментативный гидролиз. Например, сахарозу идентифицировали как a-D-глюкопиранозид, так как она гидролизуется мальтазой — ферментом, гидролизующим исключительно а-глюкопиранозиды. Этот ди-сахарид гидролизуется также ферментом, специфичным по отношению к (3-Ь-фруктофуранозидам, поэтому ему была приписана

Ферментативный гидролиз является методом, альтернативным контролируемому гидролизу полисахаридов. Ценную информацию дает не только анализ образующихся при гидролизе фрагментов (поскольку фермент действует специфично по отношению к типу моносахаридного звена и типу связи), но и устойчивость полисахарида к действию конкретного фермента или образование частично гидролизованных структур. Ферменты, гидролизующие полисахариды, для удобства разделены на две группы — эндо- и экзо-гидролазы. Эндогидролазы специфичны к типу связей и типу моно-сахаридных звеньев и вызывают статистическую фрагментацию гомополисахаридов с образованием набора гомологичных олиго-сахаридов. Примером ферментов этого типа служит а-амилаза, при действии которой на амилозу образуется набор различных олигосахаридов. Экзогидролазы специфичны к строению моно-сахаридных звеньев и конфигурации гликозидной связи, но не специфичны к строению звеньев, присоединенных по С-1 гликозидной связью. Они расщепляют полисахариды путем ступенчатого удаления остатков с невосстанавливающего конца молекулы полисахарида, в отличие от щелочного гидролиза (см. разд. 26.3.2.5). Примером экзогидролазы является р-амилаза, последовательно 0тЩепляющая от амилозы мальтозные звенья; если реакция дохо-

Оба других физико-химических метода определения конфигурации-гликозидной связи основаны на различиях в спектральной характеристике экваториального и аксиального атомов водорода, связанных с гли-, козидным центром в аномерных гликопиранозидах (см. гл. 2). В ИК-спект-ре аксиальному атому водорода при Сг отвечает слабый максимум погло-ч. щения при 891 ± 7 см'1', а экваториальному — при 844 ^ 8 см."1.

Весьма ценный метод определения конфигурации гликозидных связей заключается в исследовании отношения гликозидов к гликозидазам — ферментам, расщепляющим гликозидные связи (см. гл. 13). Поскольку действие всех известных гликозидаз стереоспецифично, способность определенного фермента катализировать гидролиз исследуемого гликозида позволяет установить конфигурацию гликозидной связи последнего. Так, например, способность р-глюкозидазы вызывать гидролиз арбутина — p-D-глюкопиранозида гидрохинона — доказывает р-конфигурацию гликозидной связи в этом соединении S6. Однако гликозидазы специфичны не только к конфигурации гликозидной связи, но и к стереохимии глико-зильного остатка, и, кроме того, чувствительны к природе агликона. Поэтому неспособность данного соединения к гидролизу под влиянием того или иного фермента не может служить окончательным доказательством конфигурации его гликозидной связи. С другой стороны, при работе с гликозидазами необходимо постоянно считаться с возможным присутствием примесей других ферментов (например, примесь (3-глюкоз ид азы в а-глюкозидазе), способных исказить результаты гидролиза (см. также стр. 449).




Конфигурация продуктов Конфигурации гликозидной Каталитического комплекса Конфигурации следовательно Конформация комплекса Конформации макромолекул Каталитического окисления Конформационные превращения Конформационного равновесия

-
Яндекс.Метрика