|
|
|
Главная --> Справочник терминов Проявлении хроматограммы Одномерную нисходящую хроматограмму можно получить, несколько изменив методику выполнения опыта. Подвижный растворитель, насыщенный неподвижным, наливают в небольшую кювету, закрепленную в верхней части камеры. На дно этой камеры помещают бюкс с неподвижным растворителем, насыщенным подвижным, для создания в камере атмосферы насыщенных паров, предотвращающей испарение растворителя с бумаги (рис. 40). На полоску бумаги на расстоянии 5 см от верхнего края наносят каплю исследуемого раствора. После высушивания пятна этот край полоски погружают в кювету с растворителем (подвижная фаза), который под действием капиллярных сил и сил тяжести перемещается вниз по бумаге. Хроматографирование заканчивается, когда фронт растворителя почти достигает нижнего края бумаги. Проявление хроматограммы осуществляют, как описано выше. В случае, если сложную смесь нельзя разделить с помощью одного растворителя, применяют последовательно два растворителя с различными коэффициентами распределения. Для этого используют квадратный лист бумаги (20 X 20, 30 X 30, 40 X 40 см), в левом углу которого (на расстоянии 5 см от края) наносят капли исследуемых веществ. После их высушивания бумагу помещают в камеру и опускают нижний край в растворитель, проводя хроматографирование по восходящему методу. Как только фронт растворителя достигнет верхнего края бумаги, хроматографирование заканчивают и бумагу высушивают. Затем, повернув ее на 90° против часовой стрелки, помещают во вторую камеру с другим растворителем и продолжают В адсорбционной хроматографии разделение компонентой смеси производится следующим образом: раствор смеси веществ проводят через вертикальную колонку с адсорбентом, а затем медленно пропускают через нее чистый растворитель. При промывании колонки растворителем компоненты смеси продвигаются вниз по колонке с различной скоростью, обусловливаемой степенью их сродства к адсорбенту. Благодаря этому происходит распределение растворенных веществ по высоте колонки в виде колец или зон, т. е. происходит проявление хроматограммы. Хроматографирование. В наполненную адсорбентом колонку вставляют на пробке капельною воронку и осторожно приливают из нее раствор смеси веществ в подходящем-растворителе. Когда раствор почти полностью протечет через колонку с адсорбентом, вливают в воронку чистый растворитель и начинают проявление хроматограммы. После этого продолжают проявление хроматограммы 75 мл «гептана и, когда в элюат начнет поступать флуоресцирующее вещество, меняют приемник и элгоируют антрацен смесью н-гексана и бензола (1 : 1). После удаления растворителей в вакууме (лучше при отгонке на водяной бане) получают чистый антрацен, который заметно флуоресцирует при дневном свете. Затем из капельной воронки сразу приливай)? раствор смеси 2,4-динитрофенилгидразонов бензальдегида'(100 мг) и циклогексанона (100 мг) Б 50 мл хлороформа. Как только понижающийся уровень раствора дойдет до пробки над адсорбентом, прибавляют из капельной воронки чистый хлороформ, т. е. начинают проявление хроматограммы. Рекомендуется помещать камеру в другой сосуд (или кожух) большего размера или закрывать колпаком (из бумаги, плотной материи н т. п.) для защиты от воздушных потоков и обусловливаемой ими неравномерности нагревания, следствием чего может являться неравномерное проявление хроматограммы. 10 мм от одного из краев пластинки и 20 мм от низа и быть не более 1—2 мм в диаметре. После высушивания пластинку выдерживают от 1 до 2 ч на солнечном свету или 20 мин при освещении лампой мощностью 100 Вт. Затем на ту же пластинку через 10 мм от первого пятна наносят второе пятно исходного раствора и дают ему высохнуть. Пластинку помещают в камеру и проявляют смесью циклогексана и бензола (8:1 по объему; приготовление камеры и проявление хроматограммы см. выше). Проявление прекращают, когда фронт растворителя будет в 15 мм от верха пластинки. После высушивания на воздухе отмечают число пятен на хромато-грамме. Пятно с меньшим Rf (си«-изомер) будет более интенсивным для облученного образца. (Циклогексан и бензол легко воспламеняются. Пары бензола ядовиты. Правила работы с" подобными веществами см. стр. 259). 23.16.3. Хроматографическое проявление хроматограммы Обычно проявление хроматограммы проводят в стеклянном сосуде. В сосуд заливают подвижную фазу, глубина слоя которой составляет 5 мм. Низ пластинки затем опускают в подвижную фазу. Необходимо следить за тем, чтобы пятно при точке старта находилось выше уровня растворителя в сосуде, в противном случае образец будет диффундировать в растворитель и сниматься с пластинки. 23.16.3. Хроматографическое проявление хроматограммы ... 39 Проявление хроматограммы проводят опрыскиванием ее из пульверизатора раствором нингидрана'. При этом хроматограмма должна лишь смачиваться раствором, но он не должен стекать с нее Затем хроматограмму высушивают теплым воздухом, держа ее над плиткой или горелкой Необходимо следить за тем, чтобы не происходил слишком сильный перегрев бумаги с обугливанием После высушивания на бумаге появляются пятна аминокислот, окрашенные в лиловый цвет Затем хроматограмму опрыскивают раствором сульфата никеля для закрепления пятен на бумаге Качественный состав компонентов смеси устанавливают сравнением Rf компонентов смеси с Rf «свидетелей», вычисленных по полученной хро-матограмме При проявлении хроматограммы вверху остается неразделенная и прочно адсорбированная смесь, ниже располагается оранжевая полоса и, наконец, внизу — желтая полоса. Элюи-рование хлороформом продолжают до тех пор, пока все содержимое желтой полосы не перейдет в фильтрат. Тогда приемник сменяют и элюируют оранжевую полосу смесью этилового спирта и хлороформа (1 : 50). f При проявлении хроматограммы следует опрыскать ее несколько раз из пульверизатора раствором нингидрина (так, чтобы бумага становилась только слабо влажной и на ней не образовывались струйки раствора), просушить на воздухе, а затем прогреть на пламени газовой горелки (весьма осторожно и все время передвигая) до появления лиловых пятен. Значительно лучше просушить хроматограмму постепенно в темноте. Появившиеся пятна следует легко обвести карандашом и закрепить, окунув хроматограмму в 10%-ный раствор сульфата никеля, помещенный в кювету, обычно используемую в фотографической практике. Далее хроматограмма высушивается на воздухе и вклеивается в рабочий журнал. остаются бесцветными. Иногда при таком «проявлении» хроматограммы окрашиваются как сорбент, так и вещества, но интенсивность окраски различна. «Проявителем» могут служить пары иода. Прежде чем помещать пластинку в сосуд с «проявителем», необходимо, чтобы растворитель на пластинке испарился. Иначе иод растворяется на пластинке, и нарушается различие в адсорбции "Пластинку помещают в сосуд с кристаллическим иодом на 5—10 мин. Затем пластинку вынимают и оставляют на воздухе для испарения избытка иода. Постепенно ярко -обозначаются контуры пятен веществ. При проявлении хроматограммы вслепую можно выделить разделен- При использовании хроматографии в тонком слое алифатические амины можно разделить [19] только на порошкообразной целлюлозе. Как алифатические, так и ароматические амины можно разделить на кизельгеле G-HR, но при этом требуются различные раствори-: тели для элюирования: для алифатических аминов — смесь 5 объемов 17%-ного аммиака, 10 объемов хлороформа и 11 объемов метанола; для ароматических аминов — смесь 12 объемов хлороформа и 1 объема метанола. При проявлении хроматограммы раствором 300 мг ниигидрина в смеси 100 мл бутанола и 3 мл уксусной кислоты с последующим нагреванием в течение 5 мин при 110 СС появляется пурпурная окраска в случае алифатических диаминов и красновато-коричневая — для ароматических диаминов. Это является также дополнительной проверкой значений величины RF, которая выражает относительную скорость движения растворенного вещества и растворителя. При проявлении хроматограммы следует опрыскать ее несколько раз из пульверизатора раствором нингидрина (так, чтобы бумага становилась только слабо влажной и на ней не образовывались струйки раствора), просушить на воздухе, а затем прогреть на пламени газовой горелки (весьма осторожно и все время передвигая) до появления лиловых пятен. Значительно лучше просушить хроматограмму постепенно в темноте. Появившиеся пятнз следует легко обвести карандашом и закрепить, окунув хроматограмму в 10%-ный раствор сульфата никеля, помещенный в кювету, обычно используемую в фотографической практике. Далее хроматограмма высушивается на воздухе и вклеивается в рабочий журнал. В лабораторных условиях для хроматографирования обычно пользуются простым прибором, изображенным на рис. 142. Колонкой служит стеклянная трубка, суженная в нижней части. Размеры трубки устанавливают в зависимости от условий опыта и от предъявляемых требований; одно из обычных соотношений между диаметром и высотой столбика адсорбента равно примерно 1:20, но это соотношение нередко варьируют в довольно значительных пределах. Во всяком случае трубка не должна быть слишком широкой, так как при этом уменьшается четкость разделения зон при проявлении хроматограммы. Адсорбционная хроматография основана на различной адсор-бируемости компонентов исследуемой смеси на данном адсорбенте. Вещества, содержащиеся в смеси, образуют определенный адсорбционный ряд, в котором каждое вещество с лучшей адсор-бируемостью может вытеснять из адсорбента хуже адсорбирующееся вещество. Этим и объясняется появление отдельных зон при хроматографировании и проявлении хроматограммы. честве неподвижной фазы, так как в большинстве случаев органические вещества лучше растворимы в органических растворителях, чем в воде. Между тем желательно, чтобы коэффициент распределения адсорбируемого вещества между неподвижной и подвижной фазами был больше единицы, так как в этом случае при проявлении хроматограммы достигается лучшее разделение зон. К настоящему времени детально изучено хроматографическое поведение двенадцати гептоз и. найдено несколько систем растворителей, обеспечивающих их оптимальное разделение 19. Хроматографическая подвижность высших Сахаров, как правило, ниже, чем гексоз, но в отдельных случаях превышает подвижность пентоз. Метод хроматографии на бумаге в нескольких системах растворителей позволяет осуществить первую предварительную оценку структуры сахара и сводит к минимуму число-возможных вариантов структуры. Применение рассмотренных выше цветных реакций при обнаружении высших Сахаров на хроматограммах позволяет надежно отличать альдозы 19> 21а от кетоз 22> 23. Легкость, с которой высшие кетозы образуют 2,7-ангидропроизводные, также может быть использована для идентификации высших кетоз методом хроматографии на бумаге, поскольку ангидропроизводные кетоз дают специфическую окраску при проявлении хроматограммы смесью орцин — три-хлоруксусная кислота 24. при этом уменьшается четкость разделения зон при проявлении хроматограммы. В нижнюю часть трубки вставляют неплотный тампон из обычной или стеклянной ваты для удержания адсорбента, а в верхнюю часть трубки при помощи резиновой пробки крепят капельную воронку.  Первоначальное образование Присутствии поверхностно Присутствии растворителя Присутствии родиевого Параллельном расположении Присутствии следующих Присутствии специальных Присутствии свободного Присутствии третичных |
- |
Навигация